以Ligilactobacillus cholophilus BD7642来源的胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH）g1294为研究对象，重点探讨其活性位点突变对酶特异性的影响。首先，通过甘氨酸扫描技术对BSH g1294活性中心进行系统性突变，并采用平板点样法评估突变体酶活性；利用高效液相色谱分析突变体对6 种胆盐的水解特异性。针对关键位点N81位点进行饱和突变，结合分子模拟对接分析突变体与野生酶的差异。结果表明，与野生酶相比，部分位点突变导致酶活性消失，N81G和N174G突变体特异性增加，其中N81G水解特异性更优。N81位点饱和突变中的多个突变体酶活性变化明显，且水解能力各异。分子模拟对接表明，N81G突变体可通过减少催化位点Cys2与甘氨胆酸之间的空间位阻获得水解能力。综上，N81G突变体具有优于野生酶的特异性，且BSH对胆酸的分子识别机制可能并非简单的氨基酸识别，这可为理性设计BSH g1294酶工程改造提供新思路。

人体中肠道微生物的胆盐水解酶(BSH)通过对初级胆汁酸 (BAs) 的解偶联可以丰富宿主的胆酸池，调节肠道健康。胆盐水解酶对胆汁酸存在水解特异性，而这种特异性与菌株的适应性和肠道定殖密切有关，引起研究人员的高度关注。本研究对前期在Ligilactobacillus cholophilu BD7642中发现的胆盐水解酶g1294做进一步分析，了解该酶的特性。方法与结论：首先对前期预测的活性中心进行了甘氨酸扫描，通过牛磺脱氧胆酸钠平板点板发现部分位点突变使得该酶牛磺脱氧胆酸钠酶活性丧失，但是有趣的是g1294-N81G突变体呈现出更大的沉淀圈，利用高效液相色谱 (HPLC) 分析突变体对6种胆盐的水解特异性，g1294-N81G突变体和g1294-N174G突变体改变了野生酶g1294的特异性，g1294-N81G突变体更优。于是利用随机碱基突变对N81位点饱和突变，发现该位点的多个突变体的酶活性变化明显，且对不同的胆酸的水解能力发生改变。利用分子模拟对接分析g1294-N81G突变体与野生酶对接甘氨酸胆酸的差异，发现突变体减少了催化位点Cys2与甘氨酸胆酸之间的阻碍，这可能是赋予了该突变体水解甘氨酸胆酸的能力的原因。我们的研究结果说明胆盐水解酶和胆酸之间的特异性可能不是简单的识别氨基酸和胆酸部分，未来可以对胆盐水解酶g1294-N81G突变体蛋白的结构展开进一步研究，可以推动我们对胆盐水解酶的认识，也可以为合成生物学理性改变胆盐水解酶活性提供参考。